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鲫鱼囊胚细胞干扰素的诱导及部分特性
文章来源:中国渔药信息网    2017-2-4 18:00:02
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自1957年发现干扰素(Interferon,IFN)后,陆续有关于鱼类干扰素的报道[1~9]。干扰素是一种细胞因子,不仅有广泛的抗病毒活性,而且还有明显的免疫调节等功能。鱼类培养细胞[1~3]和鱼体[4,5]接种病毒后都能诱导产生干扰素。利用鱼类干扰素基因或相关基因进行基因工程抗病毒病育种,是解决鱼类抗病育种的一条途径,为此我们开展了鱼类干扰素的研究,发现经紫外线灭活的草鱼呼肠孤病毒(GCRV)是一种高效诱导剂,能诱导几种鲤科鱼类细胞产生高滴度的抗病毒活性物质[10],对从鲫鱼囊胚细胞(CAB)中诱导的抗病毒物质的主要生物学特性、理化特性及抗病毒机制进行了研究,表明是鲫鱼干扰素。本文报道这一研究结果。 
  1 材料与方法
  1.1 细胞
  鲫鱼囊胚细胞系(CAB)[11]、草鱼囊胚细胞系(GCB)、稀有鱼 句鲫胚胎细胞系(GRE)、草鱼肾细胞系(GCK)、甲鱼蹼细胞(CTW)均由本实验室建立;草鱼肾细胞系(CIK)[12]由中国科学院长江水产研究所建立。细胞用10%新生牛血清(杭州四季青产品,使用时56℃灭活30min)的TC-199(GIBCO产品)培养基置28℃培养[13],CTW培养于30℃培养箱。
  1.2 病毒
  草鱼呼肠孤病毒GCRV(原称草鱼出血病病毒GCHV)[14]和甲鱼虹彩病毒STIV[15](深圳市动植物检疫局江育林研究员惠赠)分别在CIK细胞和CAB细胞上繁殖并检测病毒滴度。
  1.3 抗病毒物质的诱导
  紫外线灭活GCRV采用本实验室方法[10],灭活前病毒滴度为5×109TCID50/mL。CAB细胞按常规方法传代[13],28℃培养,4d长成致密单层。去掉细胞培养上清液,用无血清培养基洗1次,加入紫外线灭活的GCRV(诱导病毒剂量为病毒灭活前100TCID50/细胞)于28℃吸附2h。去掉诱导病毒液,用无血清培养基洗3次,再加入无血清培养基,28℃继续培养细胞2d,收集细胞培养上清液,用35000r/min超离心去除残余的诱导病毒,以孔径为10nm的微孔滤器过滤细胞碎片后即抗病毒物质样品,供抗病毒滴度的检测及其它实验用。
  1.4 抗病毒物质及抗病毒滴度的检测
  采用微量细胞病变(CPE)抑制法[10],除非特别说明均在CAB细胞上检测。细胞传代于96孔板(Nunc产品)24h后,去掉培养基,加入用维持液3×系列稀释的抗病毒物质样品。每个稀释度3孔,每孔0.1mL。8h后加入10000TCID50/孔的GCRV。同时设不加抗病毒物质样品的病毒对照与不加病毒的细胞对照。24℃培养2d后,待病毒对照孔细胞CPE完全时,固定、染色。以抑制50%CPE出现的最高稀释度作为一个抗病毒单位,抗病毒物质的滴度用u/mL表示。
  1.5 GCHV兔抗血清的制备
  参照文献[16]方法。
  1.6 抗病毒物质的理化特性分析
  抗病毒物质分别经如下处理:(1)温度:56℃ 2h,60℃ 1h,65℃ 1h,70℃ 1h;(2)pH 2和pH 11处理72h,4℃;(3)冻融处理:1次,3次,6次,9次;(4)乙醚处理4℃,30min;(5)酶处理:分别用DNase 100μg/mL,RNase 100μg/mL,Trypsin 500μg/mL,在37℃处理2h;(6)紫外线室温处理30min,然后检测抗病毒活性。
  1.7 DNA抑制剂对抗病毒物质抗病毒效应的影响
  用ActD处理96孔板单层细胞10h后加入抗病毒物质样品,设加ActD的正常细胞对照与加ActD和GCRV的病毒对照,结果与未加ActD的样品作比较,观察抗病毒物质的抗病毒滴度变化。
  2 结果
  2.1 抗病毒物质的诱导
  GCRV在紫外线照射5min后全部失活[10]。灭活的GCRV诱导CAB细胞的培养上清液,经35000r/min超速离心、过滤去除残余病毒和细胞碎片后,能诱导多种鲤科鱼类培养细胞CAB、CIK、GCB、GRE对GCRV的抗性,其中对CAB、GCB、GRE细胞的保护作用尤为明显(表1),表明灭活的GCRV能诱导CAB细胞产生高滴度的抗病毒活性物质。抗病毒物质的诱导产量受诱导温度、细胞日龄、血清及病毒诱导剂量等因素的影响,ActD具有超诱导作用,诱导产生的抗病毒物质具有启动效应[10]。
表1 抗病毒物质在几种鲤科鱼类培养细胞中对GCRV的抑制作用
  Table 1 Activity of antiviral substance to GCRV in several cultured fish cell lines
细胞系 Cell lineCABCIKGCBGRE
抑制滴度 Inhibition titer (u/mL)887514499214061

  2.2 几种因素对抗病毒活性的影响  实验中发现,当所获得的抗病毒物质浓度(在CAB细胞上的最初效价为2500u/mL)和攻击病毒剂量(10000TCID50/孔)一定时,抗病毒物质的抗病毒活性受细胞密度、细胞培养温度及与受体细胞混合培养时间的影响。
  2.2.1 细胞密度
  在96孔板中,细胞密度高于2×104细胞/孔,能铺成致密、光滑的单层。细胞密度过高,细胞培养液的pH容易过酸,影响抗病毒物质的抗病毒活性(表2)。
表2 不同细胞密度对抗病毒物质活性的影响
  Table 2 Effect of CAB cell density on the activity of antiviral substance
细胞密度 Cell density (×104cells/well)2.557.510
抑制滴度 Inhibition titer (u/mL)195021002020860

  2.2.2 培养温度
  图1表明,培养温度高于24℃时,抗病毒物质对细胞的保护作用显著降低,由于本实验室鱼类细胞培养的最适温度为28℃,因此在检测抗病毒物质的抗病毒活性时细胞培养温度改为24℃。 

图1 细胞培养温度对抗病毒物质活性的影响
  Fig.1 Effect of incubation temperature on the activity of antiviral substance in CAB cells
  2.2.3 保护细胞的时间
  加入GCRV前,抗病毒物质与细胞共同培养9h,对细胞的保护作用逐步增加,16h后趋于稳定。这表明抗病毒活性是随着抗病毒物质对细胞诱导时间的延长而增加,细胞必须经一段时间诱导后,才处于最佳抗病毒状态(图2)。 

图2 抗病毒物质与CAB细胞共同培养时间对其抗病毒活性的影响
  Fig.2 Effect of incubation time of antiviral substance with CAB cells
  before GCRV challenge on the activity of antiviral substance
  2.3 抗病毒物质的理化特性分析
  抗病毒物质经各种理化因子处理后,其抗病毒活性如表3。结果表明,这种抗病毒物质不受DNase 1、RNase的破坏,对Trypsin敏感,因此是一种蛋白质。耐强酸、强碱,56℃处理2h抗病毒活性不降低,4℃下存放20个月,其抗病毒活性仍保持最初的10%,对温度有一定稳定性。同时抗病毒活性也不受乙醚和紫外线照射等影响。
表3 几种理化因子对抗病毒物质活性的影响
  Table 3 Influence of some physiochemical factors on the activity of antiviral substance
处理方法 
  Treatment抑制滴度 Inhibition titer (u/mL)
实验组 Test group对照组 Control group
56℃,2h17731773
60℃,1h5611773
65℃,1h5611773
70℃,1h1781773
4℃,20months1781773
pH 2,4℃,3d17731773
pH 11,4℃,3d17731773
Freezing-thawing 1,3,6,9 times17731773
DNase l,37℃,2h17731773
RNase,37℃,2h17731773
Trypsin,37℃,2h01773
Ether,4℃,30min17731773
Ultraviolet,30min17731773

  2.4 GCRV兔抗血清对抗病毒物质活性的影响  抗病毒物质(在CAB细胞上的最初效价1773u/mL)与抗GCRV兔血清(在CAB细胞上的效价为3380u/mL)等体积混合,置28℃、4h后检测抗病毒活性。实验表明,GCRV特异性抗体不能中和该物质的抗病毒活性(表4)。
表4 GCRV兔抗血清对抗病毒物质活性的影响
  Table 4 Effect of rabbit anti-GCRV serum on activity of antiviral substance
处理方法 Treatment抑制滴度 Inhibition titer (u/mL)
200μL antiviral substance+200μL anti-GCRV serum560
200μL antiviral substance+200μL TC-199560

  2.5 抗病毒物质对病毒滴度的直接影响  以往的研究表明,干扰素保护细胞并非直接杀伤病毒,而是诱导宿主细胞处于抗病毒状态,抑制病毒在宿主细胞中的复制[17]。本实验中,将抗病毒物质(在CAB细胞上的最初效价为1773u/mL)与等体积的GCRV(滴度为1000000TCID50/mL)混合,置28℃,48h后测定病毒滴度。结果表明滴度只有轻微降低(表5),证实抗病毒物质的抗病毒作用并非直接灭活病毒或中和病毒活性。但是抗病毒物质与病毒同时加入,又能诱导CAB细胞对GCRV一定程度的抗性。
  2.6 DNA抑制剂对抗病毒物质抗病毒效应的影响
  干扰素的一个重要特性是其对病毒的抑制作用通过对细胞内转录和转译水平的调控途径来完成[4,17~19]。ActD是一种DNA抑制剂,它通过与细胞内DNA结合而抑制依赖于DNA的RNA合成,低浓度的ActD对细胞无毒性,对病毒在细胞中增殖引起的CPE无明显的抑制作用。细胞经不同浓度的ActD处理10h,再加入抗病毒物质(效价为1773u/mL),结果其抗病毒活性全部消失或滴度显著降低(表6)。这表明抗病毒物质的抗病毒机制依赖于细胞内RNA和蛋白质的合成。
表5 抗病毒物质对病毒滴度的直接影响
  Table 5 Direct effect of antiviral substance on GCRV titers
处理方法 Treatment病毒滴度 Viral titer (TCID50/mL)
200μL antiviral substance+200μL GCRV105.5
200μL TC-199+200μL GCRV105.8

表6 ActD对抗病毒物质活性的影响
  Table 6 Effect of ActD on activity of antiviral substance
ActD浓度 ActD concentration (μg/mL)0.10.010.0010.0001
抑制滴度 Inhibition titer (u/mL)00<5<5

  7 抗病毒物质对不同细胞和病毒的作用  GCRV是一种RNA病毒[14],STIV是一种DNA病毒[15]。抗病毒物质能不同程度地诱导多种鲤科鱼类培养细胞对GCRV的抗性,也能诱导CAB、GCB对STIV的抗性,表明在鱼类培养细胞对DNA病毒和RNA病毒都有抑制作用。但不能抑制STIV在CTW细胞中的繁殖。两种草鱼肾脏细胞CIK和GCK对抗病毒物质表现出不同的敏感性(表7)。
表7 抗病毒物质对不同细胞和病毒的作用
  Table 7 Activity of antiviral substance to different virus in different cell lines
细胞系 Cell line攻击病毒 Virus抑制滴度 Inhibition titer (u/mL)
CABGCRV8875
GREGCRV14061
GCBGCRV4992
CIKGCRV14
GCKGCRV561
CTWSTIV0
CABSTIV500
GCBSTIV997

  3 讨论  干扰素系统在生物界普遍存在。哺乳类干扰素分为3种:α、β和γ干扰素,其中α和β干扰素有相同的起源统称为Ⅰ类干扰素,γ干扰素为Ⅱ类干扰素[17]。当用病毒等诱导剂诱导时,鱼类也可以产生干扰素。体外培养的FHM细胞[1]、虹鳟性腺细胞RTG-2[9]、虹鳟鱼[5]受病毒感染后能产生干扰素。深入研究表明,这些诱导产生的干扰素耐酸、耐热,分子量在26~94kDa、等电点在5.4~7.1之间[20,21]。鱼类干扰素的这些理化特性、产生机制以及诱导细胞的起源与高等脊椎动物的Ⅰ类干扰素相似[2,6]。除此之外,Graham[6]等认为鱼类还存在Ⅱ类干扰素,他们从用ConA诱导的虹鳟白细胞上清液中发现巨噬细胞因子(MAF)和干扰素活性(在细胞上的抗病毒活性)同时存在和消失,证明MAF和干扰素活性物质实际上是同一种蛋白质,并且不耐酸(pH2),对温度敏感(60℃),而所有这些特性与哺乳类γ干扰素一致。
  近年来,我国江育林等[18]用大马哈鱼呼肠孤病毒(CSV)从草鱼性腺细胞(CO)以及邵建忠等[19]用草鱼呼肠孤病毒(GCRV)从人工诱变的抗草鱼呼肠孤病毒细胞株AHZC88中分别诱导出抗病毒活性的类干扰素物质;Murakami等[8]从人工转化的牙鲆白细胞中诱导、纯化出干扰素并克隆出干扰素基因;Snegaroff[7]发现多种病毒都具有从虹鳟白细胞中诱导干扰素的能力。所有这些都表明,鱼类干扰素确实存在,且分为不同种类,当细胞与机体受病毒感染时就会产生。
  呼肠孤病毒是一种高效的干扰素诱导剂。紫外线灭活的呼肠孤病毒感染细胞后,在细胞内降解释放dsRNA,从而诱导干扰素的产生[22]。我们用紫外线灭活的GCRV从CAB等五种鲤科鱼类细胞中能诱导出高滴度的抗病毒物质,也可能有类似机理,诱导时ActD的超诱导现象和抗病毒物质的启动作用等与哺乳类干扰素产生机制一致[10]。我们对CAB中诱导产生的抗病毒物质的深入研究表明,该物质是一种蛋白质,在多种鱼类培养细胞中对GCRV及STIV有抑制作用,但在CTW细胞中对STIV无抑制作用。GCRV特异性抗体不能中和其抗病毒活性,其保护细胞并非直接杀伤病毒,而是诱导细胞成为抗病毒状态,即抗病毒机制依赖于受体细胞RNA和蛋白质的合成,所有这些特性和诱导机制、抗病毒机制表明,这种用病毒诱导产生的抗病毒物质是一种鲫鱼干扰素。由于鲫鱼干扰系诱导于囊胚细胞,对温度不敏感,活性在pH2~11稳定,又与哺乳类α/β干扰素特性一致。
  干扰素的抗病毒作用离不开细胞膜上的特异性受体,有实验表明对干扰素不敏感的细胞是因为缺少高亲和性的干扰素受体[17]。CIK细胞对鲫鱼干扰素不敏感,尤其是对自身来源的干扰素,检测滴度为0(结果未列出),是否因为CIK细胞在本实验室传代十多年,干扰素受体发生了变异,还有待进一步研究。我们用获得的鲫鱼干扰素在草鱼鱼体中的抗GCRV感染作用表明,干扰素对防治草鱼出血病具有一定的效果(结果另文报道)。因此,无论是运用干扰素防治还是利用干扰素基因进行抗病育种,对防治乃至根治鱼类病毒病都有诱人的应用前景。
  中国科学院重点项目(KY95-J1-316);国家自然科学基金资助项目(39870602).
  张义兵(1969年-),男,硕士,主要从事鱼类遗传学的研究.
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